Protocolo – GEL DE ELETROFORESE (SDS-PAGE)

SDS-PAGE é a abreviatura de dodecil-sulfato de sódio (SDS) de poliacrilamida (PAGE), que são os principais constituintes do gel utilizado para separação de frações proteicas por eletroforese. Esta técnica foi descrita por  Laemmli (1970) e tem por finalidade a determinação da mobilidade de proteínas em gel submetido à corrente elétrica.

O SDS confere carga negativa às proteínas, facilitando a separação das mesmas por peso molecular. De acordo com o princípio da eletroforese, as frações proteicas são conduzidas no gel pela ação de carga elétrica, migrando do pólo negativo para o pólo positivo. Sendo assim, as proteínas de menor tamanho migram com maior velocidade do que as proteínas de tamanho maior, que ficam primeiramente retidas pela barreira física estabelecida pelo sistema do gel.

Uma vez separadas pelo tamanho, a posição das proteínas no gel é definida por comparação à migração de um padrão de peso molecular já conhecido, que é colocado para correr no mesmo gel, sob as mesmas condições. Dessa forma, é possível determinar com precisão o tamanho molecular de proteínas entre 5 e 250 KDa.

Protocolo – GEL DE ELETROFORESE (SDS-PAGE)

REAGENTES:

1. Tampão de Corrida (5x)

– Tris Base – 15,1 g

– Glicina – 94 g

– SDS – 5 g

– Água Ultrapura q.s.p – 1 L

Ajustar pH para 8,8 usando HCl e armazenar a 4°C.

2. Tampão de Coloração

– Coomassie Brilliant Blue (Plus One Phast Gel Blue R-350) – 1 Pastilha (100mg)

– ÁguaUltrapura – 36 mL

– Metanol – 36 mL

– Ácido Acétido Glacial – 8 mL

Filtrar em papel filtro qualitativo e armazenar a temperatura ambiente ao abrigo da luz.

3. Tampão de Descoloração

– Metanol – 450 mL

– Ácido Acético Glacial – 100 mL

– Água Ultrapura q.s.p – 1000 mL

Armazenar a temperatura ambiente.

4. Solução Acrilamida Mix 30%

– Acrilamida – 14,5 g

– N,N’ metilbisacrilamida – 0,5 g

– Água Ultrapura q.s.p – 50 mL

Filtrar em papel filtro qualitativo e armazenar a 4°C.

5. Solução Tris 1,5 M pH 8,8

– Tris Base – 18,171 g

– Água Ultrapura q.s.p – 100 mL

Ajustar pH para 8,8 usando HCl, filtrar em papel filtro qualitativo e armazenar a 4°C.

6. Solução Tris 1,0 M pH 6,8

– Tris Base – 6,057 g

– Água Ultrapura q.s.p – 50 mL

Ajustar pH para 6,8 usando HCl, filtrar em papel filtro qualitativo e armazenar a 4°C.

7. Solução SDS 10%

– SDS (Dodecil Sulfato de Sódio) – 0,5 g

– Água Ultrapura q.s.p – 5 mL

Armazenar a temperatura ambiente.

8. Solução APS 10%

– APS (Persulfato ou Peroxidissulfato de Amônio) – 0,5 g

– Água Ultrapura q.s.p – 5 mL

Aliquotar em microtubos (200 uL) e congelar a -20°C (uso único).

9. Solução Tris 50 mM pH 6,8

– Tris Base – 0,061 g

– Água Ultrapura q.s.p – 10 mL

Ajustar pH para 6,8 usando HCl.

10. Solução Redutora (Tampão de amostra)

– DTT (Ditiotreitol) – 0,0771 g

– SDS – 0,1 g

– Azul de Bromofenol – 0,005 g

– Solução Tris 50 mM pH 6,8 q.s.p – 4,5 mL

– Glicerol Anidro – 0,5 mL

Aliquotar em microtubos (300 uL) e congelar a -20°C (uso único).

 PREPARO DO GEL (15%):

SDS-PAGE

PREPARO DA AMOSTRA (PROTEÍNA):

Para análise do perfil eletroforético das amostras, 20 uL* de cada fração de interesse foi diluído em 20 uL** de tampão de amostra redutor (1:1) em fervura (95°C) por 5 minutos.

Após este período, as amostras foram aplicadas em gel de poliacrilamida de 15% e realizada a corrida a 80 V até que a linha de frente atingisse a extremidade da placa de vidro (aproximadamente 4 horas, dependendo do tamanho do gel). Após o término da corrida, o gel foi corado em solução de coloração Comassie Blue por uma hora com agitação e descorado em solução de descoloração também sob agitação.

* Vale lembrar que a quantidade de proteínas a ser separada será definida de acordo coma  necessidade de cada projeto. Para saber quantos uL de proteínas utilizar, é necessário a dosagem da quantidade total de proteínas existentes na amostra ( por Bradford, Lowry etc.).

** A quantidade de tampão redutor utilizado aqui foi na proporção 1:1. Caso necessário utilizar tampão redutor mais concentrado, dá uma conferida neste post aqui!

 

FONTE DO PROTOCOLO: DELINSKI JUNIOR, G. Produção de proteínas recombinantes ESAT-6, CFP-10 e MTSP-11. 2012. 99 f. Dissertação (mestrado em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia) – Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia, Universidade Federal do Paraná, Curitiba. 2012.

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