Protocolo – TAMPÃO REDUTOR PARA ELETROFORESE DE SDS-PAGE

*  Post relacionado ao post protocolo de eletroforese por SDS-PAGE *

Quando temos uma amostra com baixa quantidade de proteínas por mL (ou até mesmo uL), torna-se muito mais complicado planejar a corrida de um gel de eletroforese por SDS-PAGE, certo? A adição do tampão de amostra (com ou sem redução) 2x (ou seja, que deve ser aplicado à amostra na proporção 1:1) aumenta muito o volume da amostra a ser aplicada em cada poço do gel, não é mesmo?

Para isso, existe a possibilidade da utilização de tampões de amostras mais concentrados: 3x, 4x, 5x etc. E o que muda na composição das diferentes concentrações dos tampões de amostra? A CONCENTRAÇÃO DO REAGENTE AZUL DE BROMOFENOL!

Ao invéz de colocar tal reagente na concentração de 2% (0,02 g a cada 10 mL água destilada) para produzir o tampão de amostra,  deve-se adicionar o azul de bromofenol na concentração de 3% (0,03 g a cada 10 mL de água destilada) para produzir o tampão de amostra na concentração de 3x. Da mesma forma para o tampão de amostra 4x, adiciona-se azul de bromofenol a 4% e assim por diante.

E como ficam os cálculos de adição do tampão de amostra à amostra?

Para o tampão 3x, utiliza-se o volume total da amostra a ser colocada em um poço e divide este valor por 2 (ou seja, duas partes serão da amostra e a terceira parte será para o tampão – proporção 1:2). Da mesma forma, o cálculo é feito para o tampão 4x: volume total da amostra dividido por 3 (proporção 1:3), e assim por diante.

Para formar a solução final de amostra + tampão de amostra, teremos: volume total da amostra por poço + a fração correspondente ao tampão de amostra calculado conforme explicação do parágrafo anterior.

Esperamos que este post tenha ajudado!

Equipe Lista de Congressos

 

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